Notícies

Reacció en cadena de la polimerasa (PCR)

AP.BIO:

IST-1 (UE)

,

IST-1.P (LO)

,

IST-1.P.1 (EK)

Tècnica utilitzada per amplificar o fer moltes còpies d'una regió diana específica de l'ADN.

 

Punts clau:

  • Reacció en cadena de la polimerasa, o PCR, és una tècnica per fer moltes còpies d'una regió específica d'ADN in vitro (en un tub d'assaig més que en un organisme).
  • La PCR es basa en una DNA polimerasa termoestable, Taq polimerasa, i requereix ADN primers dissenyat específicament per a la regió d'ADN d'interès.
  • A la PCR, la reacció es fa en cicle repetidament a través d'una sèrie de canvis de temperatura, que permeten produir moltes còpies de la regió objectiu.
  • La PCR té moltes aplicacions pràctiques i de recerca. S'utilitza habitualment en la clonació d'ADN, el diagnòstic mèdic i l'anàlisi forense d'ADN.

Què és la PCR?

Reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és una tècnica de laboratori comuna que s'utilitza per fer moltes còpies (milions o milers de milions!) d'una regió determinada d'ADN. Aquesta regió d'ADN pot ser qualsevol cosa que interessa a l'experimentador. Per exemple, pot ser un gen la funció del qual un investigador vol entendre, o un marcador genètic utilitzat pels científics forenses per relacionar l'ADN de l'escena del crim amb els sospitosos.

Normalment, l'objectiu de la PCR és fer prou de la regió d'ADN objectiu perquè es pugui analitzar o utilitzar d'una altra manera. Per exemple, es pot enviar ADN amplificat per PCR seqüenciació, visualitzat per electroforesi en gel, o clonat en un plasmidi per a més experiments.

La PCR s'utilitza en moltes àrees de la biologia i la medicina, com ara la investigació de la biologia molecular, el diagnòstic mèdic i fins i tot algunes branques de l'ecologia.

Taq polimerasa

M'agrada Replicació del DNA en un organisme, la PCR requereix un enzim ADN polimerasa que fabriquen noves cadenes d'ADN, utilitzant les cadenes existents com a plantilles. L'ADN polimerasa que s'utilitza habitualment en la PCR s'anomena Taq polimerasa, després del bacteri tolerant a la calor del qual es va aïllar (Thermus aquaticus).

T. aquaticus viu a les aigües termals i les fonts hidrotermals. La seva ADN polimerasa és molt estable a la calor i és més activa al voltant dels 70 °\text C70 °C70, °, start text, C, end text (una temperatura a la qual un humà o E. coli L'ADN polimerasa seria no funcional). Aquesta estabilitat tèrmica fa que la polimerasa Taq sigui ideal per a PCR. Com veurem, la temperatura alta s'utilitza repetidament a la PCR desnaturalitzar l'ADN plantilla, o separar les seves cadenes.

Cebadors de PCR

Com altres ADN polimerases, Taq La polimerasa només pot fer ADN si se li dóna a imprimació, una seqüència curta de nucleòtids que proporciona un punt de partida per a la síntesi d'ADN. En una reacció de PCR, l'experimentador determina la regió d'ADN que serà copiada, o amplificada, pels cebadors que escolliu.

Els cebadors de PCR són trossos curts d'ADN monocatenari, normalment al voltant de 202020 nucleòtids de longitud. S'utilitzen dos cebadors en cada reacció de PCR, i estan dissenyats de manera que flanquegen la regió objectiu (regió que s'ha de copiar). És a dir, se'ls donen seqüències que els faran unir a cadenes oposades de l'ADN plantilla, just a les vores de la regió a copiar. Els cebadors s'uneixen a la plantilla mitjançant un aparellament de bases complementàries.

Plantilla d'ADN:

5′ TATCAGATCCATGGAGT…GAGTACTAGTCCTATGAGT 3′ 3′ ATAGTCTAGGTACCTCA…CTCATGATCAGGATACTCA 5′

Primer 1: 5′ CAGATCCATGG 3′ Primer 2:

Quan els primers s'uneixen a la plantilla, es poden estendre per la polimerasa i la regió que hi ha entre ells es copiarà.

[Diagrama més detallat que mostra la direccionalitat de l'ADN i el cebador]

Els passos de la PCR

Els ingredients clau d'una reacció de PCR són Taq polimerasa, cebadors, ADN plantilla i nucleòtids (blocs de construcció d'ADN). Els ingredients s'agrupen en un tub, juntament amb els cofactors necessaris per l'enzim, i es sotmeten a cicles repetits d'escalfament i refredament que permeten sintetitzar l'ADN.

Els passos bàsics són:

  1. Desnaturalització (96 °\text C96 °C96, °, text inicial, C, text final): escalfeu la reacció amb força per separar, o desnaturalitzar, les cadenes d'ADN. Això proporciona una plantilla de cadena única per al següent pas.
  2. Recuit (555555 - 656565°\text C°C°, text inicial, C, text final): refredar la reacció perquè els cebadors puguin unir-se a les seves seqüències complementàries a l'ADN plantilla monocatenari.
  3. Extensió (72 °\text C72 °C72, °, text inicial, C, text final): Augmenteu les temperatures de reacció de manera que Taq la polimerasa allarga els cebadors, sintetitzant noves cadenes d'ADN.

Aquest cicle es repeteix de 252525 a 353535 vegades en una reacció de PCR típica, que generalment triga entre 222 i 444 hores, depenent de la longitud de la regió d'ADN que es copia. Si la reacció és eficient (funciona bé), la regió objectiu pot passar d'una o poques còpies a milers de milions.

Això és perquè no només l'ADN original s'utilitza com a plantilla cada vegada. En canvi, el nou ADN que es fa en una ronda pot servir com a plantilla a la següent ronda de síntesi d'ADN. Hi ha moltes còpies dels cebadors i moltes molècules de Taq polimerasa flotant durant la reacció, de manera que el nombre de molècules d'ADN es pot duplicar aproximadament en cada ronda de cicle. Aquest patró de creixement exponencial es mostra a la imatge següent.

Utilitzar l'electroforesi en gel per visualitzar els resultats de la PCR

Els resultats d'una reacció de PCR normalment es visualitzen (es fan visibles) mitjançant electroforesi en gelElectroforesi en gel és una tècnica en què els fragments d'ADN són estirats a través d'una matriu de gel mitjançant un corrent elèctric, i separa els fragments d'ADN segons la mida. Normalment s'inclou un estàndard o escala d'ADN perquè es pugui determinar la mida dels fragments de la mostra de PCR.

Els fragments d'ADN de la mateixa longitud formen una "banda" al gel, que es pot veure a ull si el gel es tenyeix amb un colorant que s'uneix a l'ADN. Per exemple, una reacció de PCR que produeix un fragment de 400400400 parells de bases (pb) es veuria així en un gel:

Carril esquerre: escala d'ADN amb bandes de 100, 200, 300, 400, 500 pb.

Carril dret: resultat de la reacció de PCR, una banda a 400 pb.

Una banda d'ADN conté moltes, moltes còpies de la regió d'ADN objectiu, no només una o unes poques còpies. Com que l'ADN és microscòpic, n'han d'estar presents moltes còpies abans que puguem veure'l a ull. Aquesta és una gran part del motiu pel qual la PCR és una eina important: produeix prou còpies d'una seqüència d'ADN per poder veure o manipular aquesta regió d'ADN.

Aplicacions de la PCR

Mitjançant la PCR, una seqüència d'ADN es pot amplificar milions o milers de milions de vegades, produint prou còpies d'ADN per analitzar-les mitjançant altres tècniques. Per exemple, l'ADN es pot visualitzar mitjançant electroforesi en gel, enviat seqüenciació, o digerit amb enzims de restricció i clonat en un plasmidi.

La PCR s'utilitza en molts laboratoris d'investigació i també té aplicacions pràctiques en medicina forense, proves genètiques i diagnòstic. Per exemple, la PCR s'utilitza per amplificar gens associats a trastorns genètics a partir de l'ADN dels pacients (o de l'ADN fetal, en el cas de les proves prenatals). La PCR també es pot utilitzar per provar un bacteri o un virus d'ADN al cos d'un pacient: si el patogen està present, pot ser possible amplificar regions del seu ADN a partir d'una mostra de sang o teixit.

Exemple de problema: PCR en forense

Suposem que esteu treballant en un laboratori forense. Acabeu de rebre una mostra d'ADN d'un cabell deixat a l'escena del crim, juntament amb mostres d'ADN de tres possibles sospitosos. La vostra feina és examinar un marcador genètic concret i veure si algun dels tres sospitosos coincideix amb l'ADN del cabell d'aquest marcador.

El marcador ve en dos al·lels, o versions. Un conté una única repetició (regió marró a continuació), mentre que l'altre conté dues còpies de la repetició. En una reacció de PCR amb cebadors que flanquegen la regió de repetició, el primer al·lel produeix un fragment d'ADN de text final de 200200200 \text{bp}bpstart, b, p, mentre que el segon produeix un text de 300300300 \text{bp}bpstart, b. , p, fragment d'ADN del text final:

Al·lel marcador 1: els cebadors que flanquegen la regió de repetició amplifiquen un fragment d'ADN de 200 pb

Al·lel marcador 2: els cebadors que flanquegen la regió de repetició amplifiquen un fragment d'ADN de 300 pb

Realitzeu PCR a les quatre mostres d'ADN i visualitzeu els resultats mitjançant electroforesi en gel, tal com es mostra a continuació:

El gel té cinc carrils:

Primer carril: escala d'ADN amb bandes de 100, 200, 300, 400 i 500 pb.

Segon carril: ADN de l'escena del crim, banda de 200 bp.

Tercer carril: ADN sospitós número 1, banda de 300 pb.

Quart carril: ADN sospitós #2, bandes de 200 i 300 pb.

Cinquè carril: ADN sospitós #3, banda de 200 pb.

L'ADN de quin sospitós coincideix amb l'ADN de l'escena del crim en aquest marcador?

Tria 1 resposta:

Tria 1 resposta:

(Elecció A)

A

Sospitós 111

(Elecció B)

B

Sospitós 222

(Elecció C)

C

Sospitós 333

(Elecció D)

D

Cap dels sospitosos

[Pista]

No hem pogut qualificar la teva resposta. Sembla que heu deixat alguna cosa en blanc o heu introduït una resposta no vàlida.

Comproveu

Més informació sobre PCR i forense

En proves forenses reals d'ADN d'una escena del crim, els tècnics farien una anàlisi conceptualment similar a la de l'exemple anterior. Tanmateix, es compararien una sèrie de marcadors diferents (no només el marcador únic de l'exemple) entre l'ADN de l'escena del crim i l'ADN dels sospitosos.

A més, els marcadors utilitzats en una anàlisi forense típica no es presenten només en dues formes diferents. En canvi, són altament polimòrfica (poli = molts, transformar-se = forma). És a dir, vénen en molts al·lels que varien en petits increments de longitud.

El tipus de marcadors més utilitzat en forense, anomenat repeticions curtes en tàndem (STR), consisteixen en moltes còpies repetides de la mateixa seqüència de nucleòtids curta (normalment, de 222 a 555 nucleòtids de llarg). Un al·lel d'un STR pot tenir 202020 repeticions, mentre que un altre podria tenir 181818 i un altre només 101010^11start superscript, 1, end superscript.

En examinar diversos marcadors, cadascun dels quals té moltes formes d'al·lel, els científics forenses poden crear una "empremta digital" genètica única a partir d'una mostra d'ADN. En una anàlisi STR típica que utilitza marcadors 131313, les probabilitats d'un fals positiu (dues persones amb la mateixa "empremta digital") són inferiors a 111 en 101010 \text{billion}billionstart text, b, i, l, l, i, o, n, text final^11inici de superíndex, 1, final de superíndex!

Tot i que podem pensar que les proves d'ADN s'utilitzen per condemnar delinqüents, han jugat un paper crucial en l'exoneració de persones acusades falsament (incloent-hi algunes que havien estat empresonades durant molts anys). L'anàlisi forense també s'utilitza per establir la paternitat i identificar restes humanes d'escenes de desastre.

[Atribució i referències]

Ets estudiant o professor?

EstudiantProfessor

 


Hora de publicació: 08-gen-2021